-
Конфокалният микроскоп се отнася до един вид специален оптичен микроскоп, който може да записва оптични филийки.
Чрез осветяване и наблюдение на една граница на дифракция, оптичното нарязване се реализира в лазерна конфокална система. Това изисква двата сегмента на лъча да имат един и същ фокус, така че те са "конфокални". Противно на изображенията с широко поле, конфокалните изображения нямат обезщетение. Това само по себе си е предимство, защото дълбокият образ на пробата е ясно и богат на детайли. Най-важното предимство обаче е неговият триизмерен потенциал за визуализация с микроскопични характеристики. След като последователността на изображението е придобита по протежение на Z-стека, 3D обектът се реконструира и показва от компютъра.
- Конфокално осветление
Осветяването на източника на светлина се реализира чрез фокусиране на източника на светлина върху малка бленда (пинче) и след това се фокусира върху пробата. Когато блендата е достатъчно малка, точката на осветяване е ограничена само от дифракция, а не от геометричните параметри на източника на светлина и блендата. Обикновеният източник на светлина е голям източник на повърхностна светлина, така че е невъзможно да се фокусира върху дифракционното гранично място. Следователно, въпреки че предаването е много ниско, този вид фокусирана осветеност все още е много необходим (за традиционните източници на светлина).
Фигура 1: Осветление за конфокално изображение. Светлината от източника на светлина (LS) е фокусирана върху осветяващия Pinhole (PI) и след това влиза в пробата s ..
Лазерът като източник на светлина има много висока колимация (светлината в добрия лазер е "изключително паралелна"). Следователно, лазерът може да бъде фокусиран върху дифракционно ограничено петно през един обектив, без да се използва пиньон. Следователно, повечето конфокални микроскопи нямат просветлен отвор. Качеството на лекото петно зависи от качеството на лъча на лазера. Ако качеството не е добро, можете също да поставите осветлението. Лазерът обикновено е свързан с конфокалния микроскоп чрез оптично влакно. Самите тези влакна също действат като пиньори.
Фокулизацията и високата енергийна плътност на лазера го правят идеален източник на светлина за конфокален микроскоп. Кохерентността на лазера не е необходима характеристика на конфокалната ефективност. Напротив, това е предизвикателство за оптичните дизайнери, защото това ще причини фалшиви модели на смущения, така че са необходими стратегии за дизайн.
В допълнение, фактът, че традиционният лазер излъчва само един цвят (лазерна- "линия"), има свои собствени ограничения. При многофлуоресцентни изображения и измерване е необходимо сложно многослойно подреждане. Белият лазер умело решава проблема с многоцветните изображения.
Фигура 2: Сравнение на конфокална (дясна област) и неконфокално изображение. В оцветена от Феулген трофобласт на мишката. Много информация за неконфокални изображения не идва от фокусна равнина. Конфокалната оптика елиминира всички размити фактори и прави структурата ясна.
Конфокално откриване
Повечето детектори имат доста голяма чувствителна зона (фотоумнопултерите обикновено са няколко квадратни сантиметра). Конфокалната оптика се нуждае от сензор за точки. Следователно е необходимо да се извърши откриване на място чрез поставяне на малка бленда (пинче) в светлинния лъч. Фокусиране на светлината на пробата върху дупката, събиране и записване на предаваната светлина.
Тъй като моделът на дифракция зависи от числената бленда и дължината на вълната, е необходимо откриване на пинхол. Следователно, когато тези параметри се променят, размерът на върха трябва да се регулира.
Когато обективният обектив се промени (обикновено с промяната на числената бленда), съвременният конфокален сканиращ микроскоп автоматично ще промени диаметъра на дупката по подходящ начин. Следователно, пиньорите обикновено са проектирани като двойни или многослойни отвори.
Всъщност подходящият размер на дупката зависи не само от дължината на вълната и числената бленда, но и от вътрешното увеличение на оптичните елементи в микроскоп.
Следователно, не само нежелателно, но и грешно директно да се сравняват диаметри на пинхола в микроскопи с различни дизайни. Ако диаметърът на щипката не е зададен на оптималната стойност, системата няма да може да изпълнява оптично нарязване гладко (тоест предаване на дефокус замъгляване) или отрязване на интензивността ненужно, без да се получава допълнително оптично качество на нарязване (което води до ненужни изображения на шум).
Фигура 3: Откриване при конфокални изображения. Светлината от пробата s е фокусирана върху наблюдателния пин (PO) и след това върху детектора DE.
Оптичен път на конфокално сканиране
Пътят на конфокалния лъч в конфокалната сканираща система е само комбинацията от осветяване на точков източник и откриване на точки. Тази комбинация може да се използва като оптичен нож. Само фотони от фокусната равнина могат да бъдат предадени на сензора. Докато всички фотони от други места се филтрират. Оптичното нарязване се реализира с помощта на "пространствен филтър".
Тъй като само едно място изглежда "конфокално" изображение в даден момент, е необходимо устройство за сканиране, за да се премести мястото на обектното поле в режим на мрежата. Обикновено оптичното огледало е инсталирано на сканиращия двигател и се използва за изпълнение на процедурата за сканиране. Има пречка във времето, необходимо за сканиране на пълен кадър (обикновено) 1,024 линии. Подобренията са постигнати чрез въвеждане на високоскоростен скенер (резонансен скенер), който сканира 8, 000 или повече линии в секунда.
Само при микроскопската технология на отразена светлина може да се постигне добър оптичен резен. Това е една от причините за енергичното развитие на флуоресцентната микроскопия през последните 20 години (други причини включват изобретението на имунооцветяването, ДНК хибридизацията, флуоресцентния биосензор, квантовите точки и флуоресцентния протеин).
Фигура 4: Отляво надясно: 1. Искреният конус не само вълнува флуоресцентното багрило във фокусната равнина, но и го вълнува нагоре и надолу. Тук, представен от зелен двоен конус. 2. Емисионният отвор ефективно прихваща светлината, излъчвана отгоре на фокусната равнина. 3. В допълнение, светлината отдолу на фокусната равнина няма да премине през дупката. 4. В конфокалната система само светлината от пробата ще достигне до детектора. Откриването на щифтове ефективно ще отхвърли всяка светлина от други области. Накрая се получава истинският оптичен раздел.
